产品及特点

流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒是A型流感病毒，根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为18个亚型(H10~H108)，N可分为11个亚型(N7~N71)。甲型流感病毒 H3N2 亚型是甲型流感病毒的一种亚型。该病毒主要通过呼吸道飞沫传播，也可通过接触传播。感染甲型流感病毒 H3N2 亚型后，症状与其他甲型流感病毒亚型相似，包括发热、咳嗽、喉咙疼痛、身体疼痛、头痛、乏力等，严重时可能导致肺炎等并发症，给人类的健康造成巨大危害。因此快速检测甲型流感病毒H3N2亚型具有重要意义。本产品就是以探针法qRT-PCR技术为基础开发的对甲型流感病毒H3N2亚型的分型检测的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。

2. 引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到100拷贝/反应。

3. 提供阳性对照，便于排除假阴性结果。

4. 特异性高，引物和探针分别根据甲型流感病毒H3N2亚型RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。

5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6. 两个探针分别用FAM和Cy5标记，检测和分型同时完成。

7. 本产品足够50次20 mL体系的探针法RT-PCR反应。

8. 本产品只能用于科研。

规格及成分

本产品使用十一孔盒包装

注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入220 mL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。本试剂盒采用DNA作为阳性对照，不能有效监控核酸纯化和RT过程。如果需要RNA模板，需要另外定做。

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备试剂

样品RNA，超纯水

使用方法

一、稀释甲型流感病毒H3亚型检测标准曲线样品（以阳性对照1E1-1E6拷贝/mL这6个10倍稀释度）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。

1. 标记6个离心管，分别为A6、A5、A4、A3、A2、A1。

2. 在A1-A6号管中各加入45 mL荧光PCR专用模板稀释液。

3. 在A6号管中加入5 mL 1E7拷贝/mL的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡1分钟，得1E6拷贝/mL的标准曲线PC样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在A5号管中加入5 mL 1E6拷贝/mL的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡1分钟，得1E5拷贝/mL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在A4号管中加入5 mL 1E5拷贝/mL的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡1分钟，得1E4拷贝/mL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作得到A1-A6共六个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二、稀释甲型流感病毒N2亚型检测标准曲线样品

7. 操作同上，只是使用甲型流感病毒N2亚型的PC作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是B1-B6。

三、样品RNA的制备

8. 如果有N个样品，最好设置N+3个提取，多出的一个是甲型流感病毒H3亚型的PC（样品制备阳性对照），一个是甲型流感病毒N2亚型的PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 mL第一步和第二步所得的4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此分别作为两个PC。另外用水作为NC，水的总体积需要跟样本制备试剂盒所要求的样本体积一样。注意：本试剂盒采用DNA作为阳性对照，不能有效监控核酸纯化和RT过程。如果需要RNA模板，需要另外定做。

9. 用自选方法纯化样品的RNA。本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qRT-PCR反应（20 mL体系，在样品制备室进行）

10. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+3+1+6+6个RT-PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于甲型流感病毒H3亚型的标准曲线，另外6个用于甲型流感病毒N2亚型的标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+3+3个RT-PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于甲型流感病毒H3亚型RT-PCR阳性对照，1个用于甲型流感病毒N2亚型RT-PCR阳性对照（直接用第一步和第二步所得的两个4号稀释液作为模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：

四、数据处理

13. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。

14. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。

15. 对定量检测，以标曲样本浓度的log值为横轴，分别以甲型流感病毒H3亚型阳性对照（FAM通道）和甲型流感病毒N2亚型阳性对照（Cy5通道）的Ct值为纵轴，绘制两条标准曲线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从分别从两条标准曲线上推算出对应样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

16. 对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为甲型流感病毒H3亚型阴性，如果小于或等于35则为甲型流感病毒H3亚型阳性。如果其Cy5通道的Ct大于或等于40则为甲型流感病毒N2亚型阴性，如果小于或等于35则为甲型流感病毒N2亚型阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。